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Western Blot实验

Western Blot实验

                            Western Blot实验

一.溶液配制:

1.SDS-PAGE相关溶液
(1).电极缓冲液:
Tris:            6g
甘氨酸:        28.8g
(10% )SDS:      10ml
加1000 ml H2O    PH:8.3
(2).分离胶buffer:  100ml:
Tris:36.6g
1N HCL:(约48ml):  PH:8.9
          加水至:100ml
(3). 浓缩胶buffer: 100ml:   
Tris:      5.98g
1N HCL:(约48ml):  PH:
              加水至:100ml
(4).凝胶贮存液:  100ml:
Acr:30g
Bis:0.8g
                    加水至:100ml
(5). 4Xloading buffer:
2-Me:              20%      2ml
SDS:              8%        0.8g
Glycerin:          40%      4ml
Bromophenol Blue: 0.4%      0.04g
Tris-CL (ph6.8)  240mM    2.5ml(浓缩胶buffer)
                                    加1.5ml H2O
                          total:        10ml

(6) 染色液(快速染色配方,染色1小时
0.1% Coomassie blue, 10% acetic acid, 45% methanol
考马斯蓝R-250  1g
甲醇                    450ml
水                      450ml
冰醋酸                  100ml
     
(7). 脱色液:1000ml   
      冰醋酸:    75ml
      甲醇:      50ml
      水:        875ml
     

2.Western blot相关溶液
(1) 转移缓冲液:称取2.9g甘氨酸,5.8g Tris碱,0.37 SDS,200ml甲醇,加去离子水至1000ml,如果蛋白分子量小可不加SDS。
(2) PBS-T: NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4•12H2O 2.9g, 溶于800ml去离子水中,用盐酸调PH值为7.4,定溶至1000ml,加0.05%Tween20。
(3) 封闭液:5%脱脂奶溶于PBS中
(4) 氨基黑染液:0.2%氨基黑溶于7%乙酸中。
(5) 氨基黑脱色液:30%甲醇, 10%冰醋酸溶液。

3.细胞裂解液
(1)Buffer A: 25 mM Tris pH 7,5
50 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM EDTA
5 mM dithiothreitol (DTT)
(2)细胞核裂解液
Buffer NE:
25 mM Tris pH 7,5
0.42 M NaCl
1.5 mM MgCl2
0.5 mM EDTA
1 mM dithiothreitol (DTT)
25% Sucrose
      0.2% SDS (免疫沉淀不加)
裂解细胞前加入蛋白酶抑制剂至终浓度为 100 mg•L-1 PMSF, 1 mg•L-1 Aprotinin, 2 mg•L-1 Leupeptin

二.步骤
SDS-PAGE电泳
按照胶配置方法配制不同浓度PAGE胶,电泳置染料抵达分离胶底部,断开电源。 取下凝胶,
Western Blot
1.    电泳结束后,切下带有要转移蛋白泳道的凝胶用,右下角作一标记以确定方向及正反面。
2.    剪1块与凝胶大小相同的NC膜(不能大于凝胶),右下角作一标记,浸泡于转移缓冲液中,大约5分钟。
3.    剪8块新华1号滤纸,右下角作一标记,其大小略与凝胶相同(不能大于凝胶)。
4.    将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡,按阳极到阴极(从下至上)顺序安装转移装置: 平放底部电极,在底部电极上放置4张浸泡好的滤纸,精确对齐,将NC膜放在滤纸上,排除气泡。把SDS-PAGE 电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗,平放于NC膜上,用玻棒挤出所有气泡。在其上再放置4张浸泡好的滤纸,排出气泡。
5.    将上层电极放于夹层物上,连接电源,根据凝胶面积按1mA/cm2接通电源,电转移2~4h。100mA,2h。
6.    转移结束后,去除滤纸。把凝胶转移到考马斯亮蓝染液的托盘中染色,以检查蛋白转移是否完全。剪下含分子量标准的NC膜放在氨基黑染液中染色30秒,氨基黑脱色液脱色。
7.    将转移上蛋白的NC膜以蒸馏水略洗稍干后,浸在封闭液中4℃封闭过夜,然后用PBS-T缓冲液洗膜3次,每次10min。
8.    将膜与第一抗体室温孵育2h,第一抗体用PBS-T缓冲液按不同稀释度稀释以摸索最合适的一抗浓度,然后PBS-T缓冲液洗膜3次,每次10min。
9.    将膜与HRP标记的羊抗鼠IgG(1:5000)共同孵育1h,PBS-T缓冲液洗膜3次,每次10min。
10.    配制发光底物(按1:1混合底物液)。
11.    PBS-T缓冲液洗涤后在化学发光底物显色2分钟,凝胶成像系统观察照相。(或DAB显色液中避光显色~15分钟,出现条带后立即以水冲洗以中断显色反应)。