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KOD OneTM PCR Master Mix -Blue

KOD OneTM PCR Master Mix -Blue

KOD OneTM PCR Master Mix -Blue
产品编号:KMM-201
分类:分子生物学
品牌:TOYOBO
规格:1mlx5支
单价: ¥2000.00

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该产品是以改良型KOD DNA polymerase(UKOD)为基础开发的PCR用2× Master Mix,兼具保真性好和扩增效率高的特点。 

使用改进的延伸增强剂技术,可以实现超高速PCR反应:长度在1kb以内的片段仅需1秒, 1~10kb时延伸速度为5秒/kb,10kb及以上延伸速度为10秒/kb。该酶具有很高的反应成功率,针对含肌苷(dI)或尿嘧啶(dU)的引物模板或者粗体样品都能很好地进行扩增。此外,因为预添加了抑制酶活性和3`5`外切酶活性的单抗,可以进行高特异性的热启动PCR。





 

特征

●高速PCR

延伸时间设为1秒即可扩增1kb的片段,10kb以内延伸速度为5秒/kb,高于10kb的片段设为10秒/kb,缩短延伸时间可大幅提高PCR实验的总耗时。 




●简便

除了引物和模板之外的PCR组分都包含在预混液中,简化了配液流程,同时也提高了实验的可重复性。此外,包含电泳指示剂的KOD OneTM PCR Master Mix –Blue-(Code No. KMM-201)可以在PCR反应完成后直接点样,无需另外添加Loading Dye。


●超高的保真性
保真性约为Taq DNA 聚合酶的80倍,保持了KOD系列产品中保真性最高的水准

●粗样品也可高效扩增(实验例2)

●可以使用含肌苷(dI)或尿嘧啶(dU)的引物和模板(实验例5)



 

实验例

1. 高速PCR实验



以人基因组DNA为模板,可进行超快速PCR扩增。结果显示,KOD OneTM PCR Master Mix及KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-扩增1 kb以下的目的片段时延伸时间设为1 sec.,1 ~10 kb的目的片段时按5 sec./ kb设定可以得到清晰的扩增条带。




2. 粗样品扩增



使用KOD OneTM PCR Master Mix,比较从血液、鼠尾裂解液(碱裂解液)分别扩增人β-globin基因和小鼠Thy-1基因结果。反应根据各PCR酶推荐条件进行,延伸时间5 sec./ kb。

结果显示,只有KOD OneTM PCR Master Mix能够得到明确的条带。


3. 逆转录反应液(cDNA)的添加量对扩增的影响

逆转录反应液中残留的RNA对PCR有抑制作用,过量添加cDNA模板会使扩增效果变差。KOD OneTM PCR Master Mix不易受RNA的抑制作用。为了确认可引入的cDNA的量,通过加入不同量的cDNA模板,检测扩增TFR基因的效果。与原来的产品及其他公司的产品相比,即使添加较多的cDNA也能得到良好的扩增。





实验例10 酵母基因突变的确认

实验例11:高GC模板 mouse c-Maf cDNA全长扩增

实验例12:小鼠肝脏中ROSA26区域的PCR扩增

实验例13:从原代细胞开始的cDNA克隆

实验例14:基因表达载体间的替换

实验例15:Aspergillus fumigatus flbC 基因缺失株的 PCR 基因分型

实验例16:鸡的基因克隆用样品的制备

实验例17:植物裂解液的扩增

实验例18:腐殖酸抗性的确认

实验例19:通过高速PCR扩增17.5-40kb长片段

实验例4:不同模板量的检测灵敏度比较

实验例5:使用含肌苷的引物进行扩增

实验例6:使用互补引物进行定点突变

实验例7:扩增GC含量在70%或更高的模板

实验例8:哺乳动物细胞用表达载体中重组基因序列的3个碱基突变导入

实验例9:对丝状菌・酵母的直接PCR


 
产品内容

【KMM-101】
Master Mix                1mL ×5支
【KMM-201】
Master Mix(含染料)     1mL ×5支


基本反应条件

灭菌蒸馏水X μl
KOD One PCR Maaster Mix25μl
各引物15pmoles each
模板1~50ng(Plasmid)
10~200ng(Genome DNA)
~750ng[RNA相当](cDNA)
~5μl(粗样品)

Total Volume50μl


〈2步法循环〉*
98℃ 10sec.
68℃ 5~10sec./kb 25~45 cycles

〈3步法循环〉*
98℃ 10sec.
(Tm-5)℃ 5sec.
68℃ 1~10sec./kb 25~45 cycles

延伸时间请根据片段长度进行设定:
1~10 kb:5 sec./ kb
10 kb~:10 sec./ kb

〈Step down循环〉*
98℃, 10sec.
74℃, 1~10sec./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
72℃, 1~10sec./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
70℃, 1~10sec./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
68℃, 1~10sec./kb 15~25 cycles


*基本上以2步法循环进行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循环未见扩增时,请试一下3步法循环。另外,扩增10kb以上的目的片段时,如果出现Long PCR片段或非特异条带及弥散,请试一下Step down循环。 ※Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具

几点建议

尽可能使引物长度在25~35mer的范围(Tm>63℃)。

引物的GC含量在45~60%之间,5‘ 端GC含量在60~70%之间,3‘ 端GC含量在40~50%之间以提高扩增的特异性。

高GC或复杂样本请尝试在循环前增加预变性步骤(94℃ 2min)。

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