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流式细胞术常见问题及其解答

流式细胞术常见问题及其解答

BioLegend公司提供了哪些荧光标记抗体?

答:BioLegend公司提供APC、APC/Cy7、Alexa FluorTM 488、Alexa FluorTM 647、Alexa FluorTM 700、Biotin、Brilliant VioletTM 421、FITC、DyLightTM 594、DyLightTM 649、Pacific BlueTM、PE、PE/Cy5、PE/Cy7、PerCP、PerCP/Cy5.5共计16种荧光素标记的7000多种流式抗体供客户选择。

流式细胞实验的对照应该如何设置?什么是同型对照?
答:①在应用流式技术检测细胞表面抗原时,我们通常要设的一个对照就是同型对照。
同型对照:使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
②细胞因子的流式检测时,由于细胞经过了培养刺激活化的处理,为保证测得结果的准确性和客观性,除了同型对照外,还需另设置未刺激对照和刺激对照。
未刺激对照:激活时由于BFA等的存在抑制了胞内蛋白的转运,因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内,未刺激对照也应包含BFA等阻断剂。
激活对照:激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否,如果未达到CD69期望的水平,则激活步骤出了问题,某一试剂可能失活,过期,制备不当或溶剂污染,需制备新鲜刺激剂重新实验。

间接免疫荧光标记法如何设置同型对照?
答:同型对照的目的是消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色,而确保检测结果的真实性。在采用间接免疫荧光标记法流式检测时,所设的同型对照是与一抗相同剂量、相同亚型和相同生物素标记(或纯化)免疫球蛋白,之后的荧光标记过程与实验检测组相同即可。BioLegend公司提供了各色标记和纯化的同型对照免疫球蛋白。

为什么流式细胞术多色分析时要进行荧光补偿调整?
答:在进行流式细胞术多色分析时,待测细胞通常携带两种或两种以上的荧光素,如异硫氰荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻红蛋白(PECY5)等。这些荧光素被激光激发后发出不同波长的荧光,理论上每一种荧光通过选择恰当的滤光片可被相应的检测器检测到,而不受其他荧光的干扰。但目前这些荧光染料都具有宽发射谱性质,尽管它们的发射峰各不相同,但发射谱范围有一定的重叠,也就是说,相邻的检测器会检测到彼此的荧光信号,例如,FITC检测器会检测到少量的PE光谱,而PE检测器会检测到较多的FITC光谱。这样就影响了检测结果的准确性,因此,多色分析时必须进行光谱重叠的校正。

如何检测胞内因子抗体的特异性?
答:可以应用过量的相应细胞因子先封闭该胞内因子的荧光标记抗体,或者先用不带荧光标记的相应因子抗体先封闭细胞,进一步流式操作作对照;另外同型对照也可以判断细胞的固定、破膜的效果以及非特异性背景的影响。

为什么用CD45αSSC设门法进行流式细胞术白血病表型分析?
答:免疫分型所用的样本通常是骨髓,由于骨髓中各种大小和分化程度的细胞均有,只根据细胞大小和颗粒密度很难将不同组分的细胞区分开。而造血系统细胞的CD45表达的荧光强度(FI)与细胞分化程度有一定关系,即分化程度高的成熟白细胞其CD45的FI也高,分化程度低的细胞其FI也低,而红系细胞的FI最低。在成熟白细胞中,各类细胞其CD45的FI亦不相同,其中淋巴细胞和单核细胞的FI高于中性粒细胞。因此,根据各类细胞CD45的FI和颗粒密度不同,采用CD452SSC(侧向角散射)设门法可以将原始细胞(低FI,低或高SSC)、淋巴细胞(高FI,低SSC)、单核细胞(高FI,中等SSC)、中性粒细胞(低FI,高SSC)、红系细胞(最低FI,低或高SSC)和细胞碎片(最低FI,最低SSC)清楚地区分开。