荧光定量PCR技术
荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR
聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）
实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加（最常用的Taqman探针），非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
1．SYBR Green I
SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
2．TaqMan 探针
aqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
aqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
SYBR Green I反应设计和优化
实验步骤：
引物和扩增子的设计
反应条件确定和优化
1 引物和扩增子的设计
满足实验设计要求的软件程序很多，有免费和商业付费的，Primer3是一个很受欢迎的在线引物设计程序（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）；还有用于与引物设计和扩增子选择的商业付费软件如Beacon Designer。
扩增子设计遵循以下原则：
l 扩增长度75-200bp，片段越短扩增效率越高；但如果片段小于75bp，扩增子很难与可能存在的引物二聚体区分。
l 尽可能的避免产生二级结构。推荐使用软件如mfold （http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold）来预测扩增子在退火温度条件下。
l 模板尽量避免有长的（>4）单碱基重复。
l GC含量为50-60%
引物设计遵循一下原则
l 引物的GC含量为50-60%
l 溶解温度（Tm）在50℃-60℃之间，计算Tm时，建议使用50mM盐浓度和300nM核苷酸浓度。
l 避免产生二级结构，必要时引物结合位置设计在目标序列二级结构区域之外
l 避免超过3个G或C重复片段
l 引物末端碱基为G或C
l 检查正向和反向引物确保3’没有互补配对（避免引物二聚体产生）
l 用软件来检验引物的特异性，如Basic Local Alignment Search Tool（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）
l
2 模板
有不同厂家的DNA/RNA纯化试剂盒都可以制备模板。
3 实验体系的优化
SYBR Green I实验体系的优化
SYBR Green I实验反应成分如下：
l 含有SYBR Green I的PCR反应液
l 模板
l 引物
预混的荧光定量PCR反应液含有反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和SYBR Green I染料，这些成分可以从多个厂家购买（Fermentas，toyobo，biorad等）
1） 退火温度的优化
qPCR最佳的退火温度在具有温度梯度的仪器上很容易确定，如伯乐的MiniOpticonTM,MyiQTM,Chromo4TM和IQTM5系统。温度梯度的功能允许同时在一个温度范围内优化试验的退火温度，因此一次实验可以得到最佳的退火温度。优化的SYBR Green I qPCR反应的熔点曲线只有一个峰，对应的凝胶电泳只显示一条带。
2） 用标准曲线进行反应的评估
用未知样本系列梯度稀释样品构建标准曲线，来判定SYBR Green I反应的效率、重复性和动态范围。理想的扩增效率应在90-105%之间，标准曲线的R2>0.980，同时重复样本的CT值应相近。
Taqman探针反应设计和优化
Taqman反应包括一对PCR引物和序列特异的双标记荧光探针，分析步骤为：
l 引物和探针的设计
l 反应体系的确定和优化
1 引物和探针的设计
引物同上。
TaqMan探针（推荐使用Beacon Designer设计）的Tm比引物的Tm高5-10℃.在大多数情况下，探针小于30个核苷酸且5’端不含G,以为G能淬灭荧光信号。选择在靶序列内一段GC含量为30-80%的序列设计探针，且探针退火结合的目标单链G含量多于C含量。
常用的荧光报告基团为荧光素(FAM)，淬灭基团为BHQ1
2 实验体系的确定和优化
基于Taqman探针的qPCR反应含有如下成分：
l PCR反应液
l 模板
l 引物
l 探针
含有缓冲液，DNA聚合酶和dNTPs的PCR反应液可以从多个厂家购买。（Fermentas，biorad，Toyobo等）
Taqman实验特别注意温度条件，常用的Taqman实验用两步法代替传统的变性、退火、延伸三步PCR循环。二步法：第一步为变性，第二步为退火和延伸合并，温度为55-60℃，这确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。通常，将Taqman探针设计在其Tm在60-70℃.
优化的TaqMan实验具有高的灵敏度和特异性。用梯度稀释已知浓度模板扩增结果作标准曲线，用这条递减直线的R2或r值来确定扩增效率。理想的扩增效率应在90-105%之间，标准曲线的R2>0.980，同时重复样本的CT值应相近。
