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蓝白斑筛选的原理及方法

蓝白斑筛选的原理及方法

载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶(lacZ)的α-肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使α-肽失活,可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体,表达有功能的β-半乳糖苷酶,所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因,导致内源α-肽失活。载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌,具有β-半乳糖苷酶的ω片段,所得功能β-半乳糖苷酶(α-肽加ω片段)将底物X-Gal转化为有颜色的产物,得到蓝色菌落。在载体pGEMZ的多克隆区域,克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏,使β-半乳糖苷酶失活,得到白色菌落。α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落,因β-半乳糖苷酶只是部分失活。

重组质粒转化到合适的菌株中(JM109, DH5α),然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中,扩散到整个平板中,在37oC保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中,贮液浓度为100mM,X- Gal溶于DMF,贮液浓度为50mg/ml。IPTG和X- Gal需分装后保存在-20 oC,可保存2-4个月。