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影响蛋白与硝酸纤维素膜结合的四个主要方面

影响蛋白与硝酸纤维素膜结合的四个主要方面

影响蛋白与硝酸纤维素膜结合的四个主要方面是:

1、用于溶解捕获试剂的缓冲液
2、膜本身
3、捕获试剂本身
4、蛋白结合时的周围环境(主要指湿度)

缓冲液的使用
合适的缓冲液必需能够溶解捕获蛋白以达到应用所需浓度,并能保持稳定(换言之,即溶解蛋白并维持其结合能力)。要获得最佳的结合意味着创造利于蛋白分散于固相的最佳条件。随着捕获蛋白不同,蛋白与膜结合的优化条件也有所不同。缓冲液中捕获线的使用必需要求溶解其中的蛋白达到合适的浓度。如果浓度过低,将无法在捕获线处捕获足够的蛋白。蛋白若形成沉淀,将阻碍膜上的孔隙从而导致样品经过测试条的测试区域时出现不规则的流动。沉淀也可能阻塞仪器管道和孔洞从而损坏仪器装置。尽管去稳定剂和共沉淀剂可利于蛋白在固相表面的分布,但必需在一开始就找到合适的蛋白溶剂。pH值和离子浓度是需要进行优化的两个重要参数。

pH水平
缓冲液中pH水平在很大程度上会影响蛋白与膜的结合。由于NC膜无酸性质子,因此调节pH时仅仅能改变的是蛋白的性质。蛋白质的溶解度在其等电点(pI)时最小。过大或过小的pH值可使蛋白发生变性,使其结合特性发生巨大改变,甚至产生聚集及析出沉淀。综上原则,在探索使蛋白溶液能在固相中理想分布的条件时,对于检测线最理想的缓冲液条件是其pH值等于或接近pI的时候。

常用的缓冲系统有磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐和Tris盐缓冲液。值得注意的是,侧向流检测应用时捕获分子在膜上需被干燥,这意味着缓冲液所有组分,除可挥发成分外,都需在膜上干燥。这就使得可挥发的缓冲液如醋酸铵或碳酸铵特别受青睐。但高浓度的伯铵(例如来自Tris缓冲液)可导致捕获蛋白中酸性氨基酸残基(谷氨酸、天冬氨酸)与缓冲离子氨基间形成盐桥,从而遮盖住结合位点。

离子浓度
电解质溶液中离子的解离可降低蛋白-蛋白之间的相互作用力,因此在特定离子浓度范围内溶液中蛋白溶解度显著增强(盐溶效应)。而过高离子强度则相反(盐析效应)。这是因为此时大量的溶解离子占据越来越多的水分子,导致蛋白分子周围溶解层塌陷,蛋白分子相互作用,从而形成聚集和沉淀。根据这一原则,蛋白应在应用缓冲液中进行溶解,同时还应使其保持在利于膜固相分布的环境中。利用盐析效应可以合理的降低溶液中分子的稳定性。然而,某些盐如硫酸铵能使蛋白溶液稳定化降低,控制的难度也有所上升。盐浓度的小的变化(如蒸发导致的)会严重影响沉淀的程度。除此之外,使用这些类型的缓冲液干燥后还会将大量的盐引进膜系统中,从而严重干扰整个测试。最大众的意见是使缓冲液中的离子强度尽可能地低,以减少盐溶效应。缓冲盐(PBS,TBS)通常不被推荐。

膜的影响
膜孔径的大小决定膜的内表面积,而膜内表面积影响蛋白结合以及总结和能力。膜孔径越小蛋白结和能力越高。除此之外,由于测试开始后捕获试剂发生扩散,故而孔径的大小可以影响检测线的外观。在侧向流速高的膜中,蛋白从应用区域开始出现快速弥散,形成更宽更弥散的线。对所有膜而言,结合在膜的深部的捕获试剂无法产生信号,仅有的例外是染料结合物,在硝酸纤维素膜下10μm时仍可见。膜孔径越大,捕获蛋白在膜中的弥散百分比就可能越大。如果检测试剂是磁珠,则不需考虑上述情况。因为处于检测线的颗粒物质,无论其在膜中的位置如何,都可产生信号。对于表面积恒定的膜系列,蛋白结合的水平仅与聚合物类型以及影响膜表面能的处理试剂有关。用于膜生产的原料聚合物虽然可从不同的供货商处购买得到,但每种来源的材料性能有略微的差异。硝酸纤维素是由纤维素酯化生成,因此是一种基于天然的产品。另外,不同膜生产商对膜的处理方法不同,对产品研发者而言,比较可取的做法是安排一些实验对可能用于测试的各种膜的蛋白结合性能进行评估。蛋白结合能力的范围也应包含在检测试纸条使用的膜说明书中。

捕获试剂
用于免疫实验的经典捕获试剂是抗体,大部分是IgG。尽管如此,仍然没有两种完全相同的捕获试剂存在。优化结合最为直接的办法就是采用单克隆抗体作为捕获试剂。多克隆抗体由于蛋白成分的不纯使得整个优化变得更难控制。每个亚群在优化的条件上可有些许不同。IgA或IgM由于其结构或空间上的潜在问题,其优化的难度可能更大。除抗体以外的捕获蛋白,由于其化学性质或分子量大小等原因,优化的困难加大。一般说来,分子量越大的蛋白质与表面的结合越牢固。制备产品中其他的蛋白杂质以及载体蛋白将与捕获抗体竞争与表面的结合。通常,NC膜的蛋白结合能力超过需要进行固定的捕获蛋白的数量。但是在制备中,当测试线的捕获分子比率过低,实验将无法进行。

环境湿度的影响
硝酸纤维素膜极易受环境影响,干燥的环境可使得膜疏水性增强。低环境湿度对膜产生显著的影响,使得膜产生相当多的静电。特别是对于无背衬的膜来说,不仅处理困难,而且容易吸附尘埃颗粒,在不损伤膜的情况下这些灰尘几乎无法被清除。在加入捕获试剂时,低湿度将会对测试线结果产生重大影响,特别是使用无接触应用系统时尤为明显。在低湿度时水滴洒溅在膜上,由于其本身携带负电荷而遭到排斥,从而产生“卫星点”。在极端情况下,由于大多数的水滴无法沿直线行进,因此无法形成连续的线。而极高的环境湿度下蛋白样品快速流动,形成较宽或弥散的捕获线。尽管大多数有经验的测试研发人员都有自己一套最佳的湿度范围,但公认最佳的湿度在50%RH左右(18-22°C正常室温下40-60%)。建议在喷划捕获带前让膜在空气中达到平衡,而平衡需要的时间应通过实验研究决定。