组织DNA提取试剂盒 Tissue DNA Kit
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D3396 Tissue DNA Kit
√实验前请按说明书正确稀释以下溶液。
使用【无水乙醇】对DNA Wash Buffer 进行稀释,稀释后室温保存。
货号加入量
D3396-00 6mL
D3396-01 60mL
D3396-02 80mL(每瓶)
使用【异丙醇】对HBC Buffer 进行稀释,稀释后室温保存。
货号加入量
D3396-00 1.2mL
D3396-01 10mL
D3396-02 32mL
使用前请检查溶液是否由于低温或静置析出沉淀,如有,请置于37℃孵育至完全
溶解再使用。
提取步骤:
A. 组织基因组DNA 提取
以下方案可从最多30mg 组织中提取基因组DNA,产量取决于样品来源。
可选步骤: 虽然使用机械匀浆器匀浆组织并非必要,但是用液氮研磨组织可以提高
裂解效果和减少孵育时间。当液氮挥发完后,将粉末转移至1.5 mL 的离心管中,加入
200μl Buffer TL,开始第二步操作;
1. 称取≤30 mg 的组织,加入到1.5mL 的离心管中,加入200μl TL Buffer。将样品剪
成一块块小块可以加速裂解效果。如果样品大于30mg,可按比例提高Buffer TL 的用
量,如样品为60mg,则加入400μl Buffer TL。
2. 加入25μl OB Protease Solution,涡旋混匀,放置在55℃水浴摇床中振荡孵育至组
织完全消化。如果没有水浴摇床,水浴期间每隔20-30min 拿出涡旋混匀一次。消化时
间取决于样品使用量和组织类型,一般3 小时就能获得良好的裂解效果。
3. (选做)某些组织例如肝脏包含有高丰度的RNA,它可能会和DNA 一起回收出来,
虽然RNA 的污染并不会影响PCR 操作,但可以在这个步骤将其去除。可加入5μl(对
于30mg 的样品) RNaseA(25mg/mL)混匀,于室温下放置2-5min,继续下面的操
作;
4. 室温下,10,000×g 离心5min 去除不溶解的杂质,小心将上清液转移到新的1.5mL
中文简易说明
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离心管中而留下不溶解的杂质。
5. 加入220 μl BL Buffer,涡旋混匀。70℃水浴10min。加入Buffer BL 后,可能会
产生一些沉淀,但不会影响DNA 的回收。根据样品的使用量调节Buffer BL 的体积;
6. 加入220μl 无水乙醇(室温,96-100%),最高速度涡旋以充分混匀。如果样品的
用量超过30mg,调节无水乙醇的用量;如果这时候看到沉淀,用枪头吹打10 次以吹
散沉淀。
7. 将HiBind® DNA 结合柱套在2mL 收集管中(已提供),将第6 步得到的所有溶解
液转入HiBind® DNA 结合柱中(包括所有的沉淀物),8,000×g 离心1min 以结合
DNA,弃滤液和收集管。
8. (选做)如果样品多于30mg,就按照上面的步骤把剩下的裂解液转入HiBind® DNA
结合柱,确保所有的溶液都通过HiBind® DNA 结合柱;
9. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的2mL 收集管中,加入500 μl HBC Buffer 至
HiBind® DNA 结合柱中,8,000×g 离心1min,弃滤液和收集管;
Note:HBC Buffer 使用前必须按照说明书用异丙醇进行稀释。
10. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的2mL 收集管中,加入700 μl DNA Wash Buffer
至HiBind® DNA 结合柱中,8,000×g 离心1min,弃滤液;
Note:DNA Wash Buffer 使用前必须按照说明书用无水乙醇进行稀释。
11. 重复步骤10,用DNA Wash Buffer 进行二次洗涤;
12. 将HiBind® DNA 结合柱套在同一个2mL 收集管中,>12,000×g 离心空甩2min
以干燥HiBind® DNA 结合柱的基质。
13. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的1.5mL 灭菌离心管,加入50-200μl 预热至70℃
Elution Buffer 至HiBind® DNA 结合柱的膜中央。室温静置3min;
14. 室温下,10000×g 离心1min,以洗脱DNA。
15. 重复步骤13-14。
注意:每次洗脱可得到60%-70%结合于柱上的DNA,因此两次洗脱的总量一般
可大于90%。然而,增加洗脱体积会减少最终产物的浓度。若想得到高浓度的DNA,
可使用50μl~100μl 的Elution Buffer 来洗脱(产量将略微下降)。洗脱体积低于
50μl 将大大减少产量。在某些情况下,加入Elution buffer 后可以在70℃温育
HiBind® DNA 结合柱以提高产量。另外可以使用第一次洗脱液进行第二次洗脱。
16. 将洗脱的DNA 保存至-20℃。
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B. 从培养细胞中提取基因组DNA
该方案适合于从5×106 个细胞中纯化25μg 的基因组DNA.
1. 准备细胞重悬液
a. 冰冻的细胞样品必须在开始之前进行解冻。离心收集细胞,用PBS 缓冲液洗涤一次,
加入200μl 4℃预冷的PBS 缓冲液重悬细胞,按照步骤2 进行操作;
b. 如果细胞悬浮生长,1,200xg 离心收集5×106 个细胞,去除培养基,用PBS 缓冲液
洗涤一次,加入200μl 4℃预冷的PBS 缓冲液重悬细胞,按照步骤2 进行操作;
c. 如果细胞贴壁生长,用胰蛋白酶消化后,收集细胞,用PBS 缓冲液洗涤两次,加入
200μl 4℃预冷的PBS 缓冲液重悬细胞,按照步骤2 进行操作;
2. 加入25μl OB Protease Solution,涡旋混匀;
3. (选做)某些培养细胞包含有高丰度的RNA,它可能会和DNA 一起回收出来,一
般情况下,RNA 的污染并不会影响PCR 操作,但可以在这步将其去除。因此,可加入
4μl RNase A(100mg/mL)混匀,于室温下放置2-5min,继续下面的操作。
4. 加入220μl Buffer BL,涡旋混匀(室温,96-100%);放置70℃水浴10min。加
入BL Buffer 后,可能会产生一些纤维状沉淀,但不会影响DNA 的回收。根据样品的
使用量调节BL Buffer 的体积;
5. 加入220μl 无水乙醇,高速涡旋混匀。根据样品的用量,调节无水乙醇的用量;如
果这时候看到沉淀,可用枪头吹打10 次打散沉淀。
6. 下面的操作请参照组织DNA 提取方案的7-16 步。
C. 从老鼠尾巴中提取基因组DNA
把已冻藏的样品和OB 蛋白酶溶液放到室温下,70℃预热Elution Buffer(每个样品要
0.5mL)。
1. 剪碎长度为0.2-0.5cm 的老鼠尾巴放置于1.5mL 的离心管中。如果有必要的话,可
灼烧伤口以防止流血。可适当地在动物耳朵上做标记,放到干净笼子里。
注:老鼠年龄不能超过6 个星期,因为超过6 个星期后,老鼠尾巴将很难裂解而很
难得到理想的回收产物。如可能的话,可在小鼠2-4 个星期时,切出小鼠尾巴,然
后保存于-70℃。
2. 加入200μl TL Buffer 和25μl OB Protease Solution,涡旋混匀;
3. 55℃摇床水浴1-4h,如果没有摇床水浴锅,可在水浴期间每隔20-30min 取出涡旋;
加入25μl OB 蛋白酶,涡旋混匀,放置55℃水浴摇床孵育1-4 小时或至充分裂解。
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如果没有水浴摇床,水域期间,每隔20-30min 拿出涡旋混匀一次。不充分的裂解会
导致柱子阻塞而降低DNA 产量。样品的消化时间取决于小鼠尾巴的使用量和老鼠的
年龄。2 周大的小鼠的0.5cm 尾巴一般只需要2 小时就能获得良好的效果。对于年龄
老的小鼠可消化过夜。注:骨和毛是不能消化的。
(选做)小鼠尾巴中的RNA 可能会和DNA 一起纯化出来。一般情况下,RNA 的
污染不会影响到PCR 反应,但可能会影响其它酶促反应。如需去除RNA,可加入
15μl RNaseA(25mg/mL)混匀,于室温孵育2min。
4. 室温下,10,000×g 离心5min 沉淀去除不溶解的杂质和毛发。小心转移上清液至新
的1.5mL 离心管中,在吸取上清液时,不要吸到任何沉淀物。
5. 加入等体积的BL Buffer 和等体积的无水乙醇,最高速度涡旋混匀。涡旋混匀是必需
的。如果这时候看到沉淀,可通过颠倒混匀沉淀。
6. 下面的操作请参照组织DNA 提取方案的步骤7-16。
D. 从石蜡包埋的组织中提取基因组DNA
1. 剪称不超过30mg 的组织(~2mm3)于2mL 离心管中;
2. 加入1mL 二甲苯,充分涡旋混匀以去除石蜡;
3. 室温下,10,000×g 离心10min;吸取上清液,不要碰到组织沉淀;
4. 加入1mL 无水乙醇洗涤去除二甲苯,室温下,最大速度离心5min;弃上清液,不
要倒出组织沉淀;
5. 重复步骤4,用无水乙醇再次洗涤;
6. 37℃,空气干燥15min;
7. 加入200μl TL Buffer 和25μl OB Protease Solution,涡旋混匀,放置在55℃水浴
摇床中振荡孵育至组织完全消化。
Note:如果没有水浴摇床,水浴期间每隔20-30min 拿出涡旋混匀一次。消化时间
取决于样品使用量和组织类型,一般3 小时就能获得良好的裂解效果。
8. 在90℃孵育30-60min;
9. 然后按“组织DNA 提取方案”的第3 步起开始往下操作;
注:组织中含有多聚甲醛,会导致RNA 或DNA 降解,降解的程度取决于固定剂
的类型,但是得到的DNA 通常都小于500bp。降解的原因跟E.Z.N.A.组织DNA
提取方案无关,而PCR 检测500bp 以下片断可以得到的良好结果。
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E. 全血与体液DNA 提取方案
1. 将样品转移到1.5mL 离心管中,加入10mM Tris-HCl、PBS 或Elution Buffer 将样
品体积调整至250μl;
2. 加入25μl OB Protease Solution 和250μl BL Buffer,涡旋混匀;
Note:加入BL Buffer 后,可能会产生一些纤维状沉淀,但不会影响DNA 的回收。
(选做)如果需要,RNA 可在此步除去:
(1) 加入4μl RNase A(100mg/mL);
(2) 室温下静置2min;
(3) 接着步骤3;
3. 70℃孵育10min,期间取出涡旋混匀一次;
4. 加入250μl 无水乙醇,涡旋混匀;
5. 将HiBind® DNA 结合柱套在2mL 收集管中,将第4 步得到的所有溶解液转入
HiBind® DNA 结合柱中,最大速度(≥10,000xg)离心1min 以结合DNA,弃滤液;
6. 将HiBind® DNA 结合柱套在2mL 收集管中,加入500μl HBC Buffer,最大速度离
心30s,弃滤液;
Note:HBC Buffer 使用前必须按照说明书用异丙醇进行稀释。
7. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的2mL 收集管中,加入700 μl DNA Wash Buffer
至HiBind® DNA 结合柱中,最大速度离心30s,弃滤液;
Note:DNA Wash Buffer 使用前必须按照说明书用无水乙醇进行稀释。
8. 重复步骤7,用DNA Wash Buffer 进行二次洗涤;
9. 将HiBind® DNA 结合柱套在同一个2mL 收集管中,最大速度离心空甩2min 以干
燥HiBind® DNA 结合柱的基质。
10. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的1.5mL 灭菌离心管,加入50-200μl 预热至70℃
Elution Buffer 至HiBind® DNA 结合柱的膜中央。室温静置2min;
11. 室温下,最大速度离心1min,以洗脱DNA。
12. 重复步骤10-11;
注意:每200μl Elution Buffer 洗脱可得到60%~70%结合于柱上的DNA,因此
两次洗脱的总量一般可大于90%。然而,增加洗脱体积会减少最终产物的浓度。若
想得到高浓度的DNA,可使用50μl-100μl 的Elution Buffer 来洗脱(产量将略微
下降)。洗脱体积低于50μl 将大大减少产量。在某些情况下,加入Elution buffer
后可以在70℃温育HiBind® DNA 结合柱以提高产量。另外可以使用第一次洗脱液
进行第二次洗脱。
13. 将洗脱的DNA 保存至-20℃。
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F. 组织基因组DNA 提取-真空/离心方案
根据组织基因组DNA 提取方案,完成对样品的裂解,匀浆,蛋白酶消化,和上HiBind®
DNA 结合柱。按照下面的步骤来代替了连续的离心操作。
1. 按照使用说明准备好真空抽滤盒,然后把V-Spin DNA 结合柱连接到真空抽滤盒上。
2. 把样品转入V-Spin HiBind® DNA 结合柱。
3. 打开抽滤装置,让样品通过HiBind® DNA 结合柱,然后关掉抽滤装置。
4. 加入500μl HBC Buffer 洗涤HiBind® DNA 结合柱,打开真空抽滤装置,让溶液通
过HiBind® DNA 结合柱。
5. 加入700μl DNA Wash Buffer 通过抽滤洗涤HiBind® DNA 结合柱。
6. 重复步骤5。
7. 把HiBind® DNA 结合柱套上2mL 的收集管,最高速度离心,(不高20,000xg)2min,
甩干HiBind® DNA 结合柱的基质。
8. 把HiBind® DNA 结合柱套上干净的1.5mL 离心管,加入100-200μl Elution Buffer,
静置1-2min,离心1min,洗脱DNA。
中文翻译仅供辅助阅读,详情请以英文说明书为准
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