组织DNA提取试剂盒 Tissue DNA Kit
组织DNA提取试剂盒 Tissue DNA Kit
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D3396 Tissue DNA Kit
√实验前请按说明书正确稀释以下溶液。
使用【无水乙醇】对DNA Wash Buffer 进行稀释，稀释后室温保存。
货号加入量
D3396-00 6mL
D3396-01 60mL
D3396-02 80mL（每瓶）
使用【异丙醇】对HBC Buffer 进行稀释，稀释后室温保存。
货号加入量
D3396-00 1.2mL
D3396-01 10mL
D3396-02 32mL
使用前请检查溶液是否由于低温或静置析出沉淀，如有，请置于37℃孵育至完全
溶解再使用。
提取步骤：
A. 组织基因组DNA 提取
以下方案可从最多30mg 组织中提取基因组DNA，产量取决于样品来源。
可选步骤： 虽然使用机械匀浆器匀浆组织并非必要，但是用液氮研磨组织可以提高
裂解效果和减少孵育时间。当液氮挥发完后，将粉末转移至1.5 mL 的离心管中，加入
200μl Buffer TL，开始第二步操作；
1. 称取≤30 mg 的组织，加入到1.5mL 的离心管中，加入200μl TL Buffer。将样品剪
成一块块小块可以加速裂解效果。如果样品大于30mg，可按比例提高Buffer TL 的用
量，如样品为60mg，则加入400μl Buffer TL。
2. 加入25μl OB Protease Solution，涡旋混匀,放置在55℃水浴摇床中振荡孵育至组
织完全消化。如果没有水浴摇床，水浴期间每隔20-30min 拿出涡旋混匀一次。消化时
间取决于样品使用量和组织类型，一般3 小时就能获得良好的裂解效果。
3. （选做）某些组织例如肝脏包含有高丰度的RNA，它可能会和DNA 一起回收出来，
虽然RNA 的污染并不会影响PCR 操作，但可以在这个步骤将其去除。可加入5μl（对
于30mg 的样品） RNaseA(25mg/mL)混匀，于室温下放置2-5min，继续下面的操
作；
4. 室温下，10,000×g 离心5min 去除不溶解的杂质，小心将上清液转移到新的1.5mL
中文简易说明
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离心管中而留下不溶解的杂质。
5. 加入220 μl BL Buffer，涡旋混匀。70℃水浴10min。加入Buffer BL 后，可能会
产生一些沉淀，但不会影响DNA 的回收。根据样品的使用量调节Buffer BL 的体积；
6. 加入220μl 无水乙醇（室温，96-100%），最高速度涡旋以充分混匀。如果样品的
用量超过30mg，调节无水乙醇的用量；如果这时候看到沉淀，用枪头吹打10 次以吹
散沉淀。
7. 将HiBind® DNA 结合柱套在2mL 收集管中（已提供），将第6 步得到的所有溶解
液转入HiBind® DNA 结合柱中（包括所有的沉淀物），8,000×g 离心1min 以结合
DNA，弃滤液和收集管。
8. （选做）如果样品多于30mg，就按照上面的步骤把剩下的裂解液转入HiBind® DNA
结合柱，确保所有的溶液都通过HiBind® DNA 结合柱；
9. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的2mL 收集管中，加入500 μl HBC Buffer 至
HiBind® DNA 结合柱中，8,000×g 离心1min,弃滤液和收集管；
Note：HBC Buffer 使用前必须按照说明书用异丙醇进行稀释。
10. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的2mL 收集管中，加入700 μl DNA Wash Buffer
至HiBind® DNA 结合柱中，8,000×g 离心1min,弃滤液；
Note：DNA Wash Buffer 使用前必须按照说明书用无水乙醇进行稀释。
11. 重复步骤10，用DNA Wash Buffer 进行二次洗涤；
12. 将HiBind® DNA 结合柱套在同一个2mL 收集管中，＞12,000×g 离心空甩2min
以干燥HiBind® DNA 结合柱的基质。
13. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的1.5mL 灭菌离心管，加入50-200μl 预热至70℃
Elution Buffer 至HiBind® DNA 结合柱的膜中央。室温静置3min；
14. 室温下，10000×g 离心1min，以洗脱DNA。
15. 重复步骤13-14。
注意：每次洗脱可得到60%-70%结合于柱上的DNA，因此两次洗脱的总量一般
可大于90%。然而，增加洗脱体积会减少最终产物的浓度。若想得到高浓度的DNA，
可使用50μl～100μl 的Elution Buffer 来洗脱（产量将略微下降）。洗脱体积低于
50μl 将大大减少产量。在某些情况下，加入Elution buffer 后可以在70℃温育
HiBind® DNA 结合柱以提高产量。另外可以使用第一次洗脱液进行第二次洗脱。
16. 将洗脱的DNA 保存至-20℃。
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B. 从培养细胞中提取基因组DNA
该方案适合于从5×106 个细胞中纯化25μg 的基因组DNA.
1. 准备细胞重悬液
a. 冰冻的细胞样品必须在开始之前进行解冻。离心收集细胞，用PBS 缓冲液洗涤一次，
加入200μl 4℃预冷的PBS 缓冲液重悬细胞，按照步骤2 进行操作；
b. 如果细胞悬浮生长，1,200xg 离心收集5×106 个细胞，去除培养基，用PBS 缓冲液
洗涤一次，加入200μl 4℃预冷的PBS 缓冲液重悬细胞，按照步骤2 进行操作；
c. 如果细胞贴壁生长，用胰蛋白酶消化后，收集细胞，用PBS 缓冲液洗涤两次，加入
200μl 4℃预冷的PBS 缓冲液重悬细胞，按照步骤2 进行操作；
2. 加入25μl OB Protease Solution，涡旋混匀；
3. （选做）某些培养细胞包含有高丰度的RNA，它可能会和DNA 一起回收出来，一
般情况下，RNA 的污染并不会影响PCR 操作，但可以在这步将其去除。因此，可加入
4μl RNase A(100mg/mL)混匀，于室温下放置2-5min，继续下面的操作。
4. 加入220μl Buffer BL，涡旋混匀（室温，96-100%）；放置70℃水浴10min。加
入BL Buffer 后，可能会产生一些纤维状沉淀，但不会影响DNA 的回收。根据样品的
使用量调节BL Buffer 的体积；
5. 加入220μl 无水乙醇，高速涡旋混匀。根据样品的用量，调节无水乙醇的用量；如
果这时候看到沉淀，可用枪头吹打10 次打散沉淀。
6. 下面的操作请参照组织DNA 提取方案的7-16 步。
C. 从老鼠尾巴中提取基因组DNA
把已冻藏的样品和OB 蛋白酶溶液放到室温下，70℃预热Elution Buffer(每个样品要
0.5mL)。
1. 剪碎长度为0.2-0.5cm 的老鼠尾巴放置于1.5mL 的离心管中。如果有必要的话，可
灼烧伤口以防止流血。可适当地在动物耳朵上做标记，放到干净笼子里。
注：老鼠年龄不能超过6 个星期，因为超过6 个星期后，老鼠尾巴将很难裂解而很
难得到理想的回收产物。如可能的话，可在小鼠2-4 个星期时，切出小鼠尾巴，然
后保存于-70℃。
2. 加入200μl TL Buffer 和25μl OB Protease Solution，涡旋混匀；
3. 55℃摇床水浴1-4h，如果没有摇床水浴锅，可在水浴期间每隔20-30min 取出涡旋；
加入25μl OB 蛋白酶，涡旋混匀，放置55℃水浴摇床孵育1-4 小时或至充分裂解。
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如果没有水浴摇床，水域期间，每隔20-30min 拿出涡旋混匀一次。不充分的裂解会
导致柱子阻塞而降低DNA 产量。样品的消化时间取决于小鼠尾巴的使用量和老鼠的
年龄。2 周大的小鼠的0.5cm 尾巴一般只需要2 小时就能获得良好的效果。对于年龄
老的小鼠可消化过夜。注：骨和毛是不能消化的。
（选做）小鼠尾巴中的RNA 可能会和DNA 一起纯化出来。一般情况下，RNA 的
污染不会影响到PCR 反应，但可能会影响其它酶促反应。如需去除RNA，可加入
15μl RNaseA(25mg/mL)混匀，于室温孵育2min。
4. 室温下，10,000×g 离心5min 沉淀去除不溶解的杂质和毛发。小心转移上清液至新
的1.5mL 离心管中，在吸取上清液时，不要吸到任何沉淀物。
5. 加入等体积的BL Buffer 和等体积的无水乙醇，最高速度涡旋混匀。涡旋混匀是必需
的。如果这时候看到沉淀，可通过颠倒混匀沉淀。
6. 下面的操作请参照组织DNA 提取方案的步骤7-16。
D. 从石蜡包埋的组织中提取基因组DNA
1. 剪称不超过30mg 的组织（～2mm3）于2mL 离心管中；
2. 加入1mL 二甲苯，充分涡旋混匀以去除石蜡；
3. 室温下，10,000×g 离心10min；吸取上清液，不要碰到组织沉淀；
4. 加入1mL 无水乙醇洗涤去除二甲苯，室温下，最大速度离心5min；弃上清液，不
要倒出组织沉淀；
5. 重复步骤4，用无水乙醇再次洗涤；
6. 37℃，空气干燥15min；
7. 加入200μl TL Buffer 和25μl OB Protease Solution，涡旋混匀，放置在55℃水浴
摇床中振荡孵育至组织完全消化。
Note：如果没有水浴摇床，水浴期间每隔20-30min 拿出涡旋混匀一次。消化时间
取决于样品使用量和组织类型，一般3 小时就能获得良好的裂解效果。
8. 在90℃孵育30-60min；
9. 然后按“组织DNA 提取方案”的第3 步起开始往下操作；
注：组织中含有多聚甲醛，会导致RNA 或DNA 降解，降解的程度取决于固定剂
的类型，但是得到的DNA 通常都小于500bp。降解的原因跟E.Z.N.A.组织DNA
提取方案无关，而PCR 检测500bp 以下片断可以得到的良好结果。
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E. 全血与体液DNA 提取方案
1. 将样品转移到1.5mL 离心管中，加入10mM Tris-HCl、PBS 或Elution Buffer 将样
品体积调整至250μl；
2. 加入25μl OB Protease Solution 和250μl BL Buffer，涡旋混匀；
Note：加入BL Buffer 后，可能会产生一些纤维状沉淀，但不会影响DNA 的回收。
（选做）如果需要，RNA 可在此步除去：
(1) 加入4μl RNase A（100mg/mL）;
(2) 室温下静置2min；
(3) 接着步骤3；
3. 70℃孵育10min，期间取出涡旋混匀一次；
4. 加入250μl 无水乙醇，涡旋混匀；
5. 将HiBind® DNA 结合柱套在2mL 收集管中，将第4 步得到的所有溶解液转入
HiBind® DNA 结合柱中，最大速度（≥10,000xg）离心1min 以结合DNA，弃滤液；
6. 将HiBind® DNA 结合柱套在2mL 收集管中，加入500μl HBC Buffer，最大速度离
心30s，弃滤液；
Note：HBC Buffer 使用前必须按照说明书用异丙醇进行稀释。
7. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的2mL 收集管中，加入700 μl DNA Wash Buffer
至HiBind® DNA 结合柱中，最大速度离心30s，弃滤液；
Note：DNA Wash Buffer 使用前必须按照说明书用无水乙醇进行稀释。
8. 重复步骤7，用DNA Wash Buffer 进行二次洗涤；
9. 将HiBind® DNA 结合柱套在同一个2mL 收集管中，最大速度离心空甩2min 以干
燥HiBind® DNA 结合柱的基质。
10. 将HiBind® DNA 结合柱套在新的1.5mL 灭菌离心管，加入50-200μl 预热至70℃
Elution Buffer 至HiBind® DNA 结合柱的膜中央。室温静置2min；
11. 室温下，最大速度离心1min，以洗脱DNA。
12. 重复步骤10-11；
注意：每200μl Elution Buffer 洗脱可得到60%~70%结合于柱上的DNA，因此
两次洗脱的总量一般可大于90%。然而，增加洗脱体积会减少最终产物的浓度。若
想得到高浓度的DNA，可使用50μl-100μl 的Elution Buffer 来洗脱（产量将略微
下降）。洗脱体积低于50μl 将大大减少产量。在某些情况下，加入Elution buffer
后可以在70℃温育HiBind® DNA 结合柱以提高产量。另外可以使用第一次洗脱液
进行第二次洗脱。
13. 将洗脱的DNA 保存至-20℃。
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F. 组织基因组DNA 提取－真空/离心方案
根据组织基因组DNA 提取方案，完成对样品的裂解，匀浆，蛋白酶消化，和上HiBind®
DNA 结合柱。按照下面的步骤来代替了连续的离心操作。
1. 按照使用说明准备好真空抽滤盒，然后把V-Spin DNA 结合柱连接到真空抽滤盒上。
2. 把样品转入V-Spin HiBind® DNA 结合柱。
3. 打开抽滤装置，让样品通过HiBind® DNA 结合柱，然后关掉抽滤装置。
4. 加入500μl HBC Buffer 洗涤HiBind® DNA 结合柱，打开真空抽滤装置，让溶液通
过HiBind® DNA 结合柱。
5. 加入700μl DNA Wash Buffer 通过抽滤洗涤HiBind® DNA 结合柱。
6. 重复步骤5。
7. 把HiBind® DNA 结合柱套上2mL 的收集管，最高速度离心，（不高20,000xg）2min，
甩干HiBind® DNA 结合柱的基质。
8. 把HiBind® DNA 结合柱套上干净的1.5mL 离心管，加入100-200μl Elution Buffer，
静置1-2min，离心1min，洗脱DNA。
中文翻译仅供辅助阅读，详情请以英文说明书为准
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