活细胞/死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/EthD-I双染法)
活细胞/死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/EthD-I双染法)
活细胞/死细胞双染试剂盒
产品编号：HR8279
产品组成：
组份500T 1000T
试剂A：染色液Calcein AM 100μL 200μL
试剂B：染色液EthD-I 200μL 400μL
试剂C：染料稀释液10ml 20ml
储存条件：
试剂A-20℃避光干燥保存；试剂B 和试剂C 2-8℃保存。有效期1 年。
【注】：
● 长期不用可以-20℃保存。
● 染色液Calcein-AM 注意防潮,避免反复冻融。
● 染色液A 为DMSO 溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。
注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否者
容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
● 试剂B 溶解后需要用吸头吹打混匀。
产品简介：
活细胞/死细胞染色试剂盒是采用Calcein-AM/EthD-I 双染细胞的方法染色
活细胞和死细胞。
Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,Calcein-AM 由
于在Calcein 的基础上加强了疏水性,因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到
细胞质后,酯酶会将其水解为Calcein 留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类
试剂(如BCECF-AM 和Carboxy-fluorescein diacetate)相比,Calcein-AM 是最适
合作为荧光探针去染活细胞的,因为它的细胞毒性很低。Calcein 的激发和发射波
长分别为490nm 和515nm。Calcein-AM 仅对活细胞染色。
作为核染色染料的EthD-I(Ethidium Homodimer 1)不能穿过活细胞的细胞膜,
它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA 双螺旋从而产生红
色荧光(激发：488nm,528nm,发射：617nm),因此EthD-I 仅对死细胞染色。
由于Calcein-DNA 和EthD-I-DNA 都可被490nm 激发,因此可用荧光显微镜同
2
时观察活细胞和死细胞。用545nm 激发,仅可观察到死细胞。根据以上特
点,Calcein,AM 和EthD-I 经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。
检测方法：
● 流式细胞仪● 荧光显微镜● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞● 贴壁细胞
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦●离心机● PBS/HBSS(不含酚红)
使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至
管底,避免开盖时液体洒落。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
● 试剂A 为DMSO 溶液,冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管壁、
吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸
头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
● 试剂A 为了便于观察防止误操作导致损失,在试剂盒中时是采用透明管包装,
收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
● 由于Calcein-AM 稳定性比较差,染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。
● Calcein-AM 对湿度非常敏感,若是Calcein-AM 溶液每次取完需要量后,必须
紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。不可使用含水的吸头。
● 试剂A 母液请拧紧螺旋盖,避免受潮失效。
● 染色液A 为DMSO 溶液,冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管
壁、吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固
在吸头内壁产生损耗。
● 以下实验步骤仅供参考,以实际的样本和文献参考步骤进行调整。可以染色悬
浮培养细胞、贴壁细胞、制备的细胞爬片、涂片等原位染色。
使用方法：
1、染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C 将染色液A 和B 分别10 倍稀释。
每10ml HBSS 缓冲液/无血清培养基中加入100μL 稀释过的染色液A，充分混匀，
即成染色工作液A。
3
每10ml HBSS 缓冲液/无血清培养基中加入20-200μL 稀释过的染色液B，充分混
匀，即成染色工作液B。
【注】：
● 由于不同细胞系的最佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验,以确定
Calcein-AM 和EthD-I 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到
最好的荧光结果。Calcein-AM 染色时间一般15-30 分钟，EthD-I 染色时间一般
1-5 分钟。
● 一般细胞Calcein-AM 的使用终浓度为试剂盒中母液的1000 倍稀释即可,个别
细胞可能需要提高浓度至500 倍稀释或者延长染色时间。EthD-I 的使用终浓度为
试剂盒中母液的1000-8000 倍稀释，常用2000-5000 倍。
● Calcein-AM 溶液和EthD-I 溶液分开进行染色,先用Calcein-AM，再用EthD-I。
● 注意EthD-I 的浓度在染上色的前提下尽可能低，否则可能有细胞毒性，使原
本的活细胞染上色。
● 可以不用本试剂盒的染料稀释液，直接用HBSS、无血清培养基配染色工作液。
不可以用含血清的培养基配制。
● Calcein-AM 染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
2、收集样本细胞。
【注】：
● 根据下游检测仪器和应用需要，贴壁细胞时，可以先用胰酶-EDTA 等消化细胞，
制备成细胞悬液，也可以直接原位染色检测。
3、用PBS 洗涤细胞两次。
【注】：
● 由于培养基中的血清等含有酯酶,导致Calcein-AM 遇水会分解,会导致空白上
升,所以需要用PBS 洗涤数次直到完全洗净。
● 贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉
漂浮的死细胞。PBS 洗涤时也需要离心培养板。
4、用200μL 染色工作液A 将细胞重悬。
【注】：
● Calcein-AM 溶液和EthD-I 溶液分开进行染色，先用Calcein-AM，再用EthD-I。
● 有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F-127 到Calcein-AM
内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管需要用的Calcein-AM 内加入20%
Pluronic F-127，使Pluronic F-127 的终浓度为0.02%。
4
● 含Pluronic F-127 的Calcein-AM 溶液不可长期保存，现配现用。
5、在室温或37℃避光孵育15-20 分钟。
【注】：
● 分开染色，Calcein-AM 染色15-30 分钟，EthD-I 染色1-5 分钟即可。
● 同时染色时，一定要注意EthD-I 浓度，防止染色活细胞。
● 如果细胞本身含有有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（probenecid，1-2.5mM）
或者苯磺唑酮（sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）到孵育体系内以降低染料
Calcein-AM 泄露到胞外。
6、用PBS 洗涤细胞。
【注】：
● 如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。
7、用200μL 染色工作液B 将细胞重悬。
8、在室温或37℃避光孵育2-5 分钟。
9、用PBS 洗涤细胞。
10、用适量PBS 重悬细胞。
11、用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为
515nm 和617nm。
【注】：
● 在荧光显微镜下观察时,如果背景高,可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料
后再观察。
结果分析：
荧光显微镜下,使用490±10nm 波长激发,活细胞为黄绿色,死细胞为红色。
用528nm 波长激发,能够看到红色的死细胞。
常见问题分析：
● 所有细胞都染上红色？
EthD-I 浓度过高会导致活细胞也被染色,需要优化EthD-I 的使用浓度,稀释至仅
对死细胞核染色,而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
● 细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时,细胞胞浆会有Calcein 着色并呈碎片状,而且
EthD-I 也为阳性。
